شناسایی جهش H63D ژن HFE

کیت Real-Time PCR شناسایی جهش H63D ژن HFE مناسب برای دستگاه Real-Time ABI Version 2.1

1. محتوای کیت:

Color tube	Content	Quantity
Green	H63-N Mix	400 μl
Yellow	H63-M Mix	400 μl
Red	H63-Hetero Control	60 μl
Colorless	Molecular Grade Water

1. ویژگیهای تکنیکی کلی کیت

تکنولوژی	Real-Time PCR
نوع بررسی	کیفی
توالی هدف	جهش 187 C>G ژن HFE
حساسیت	حداقل 5 ng/µl
اختصاصیت تشخیص	100%
حساسیت تشخیص	100%
ارزیابی ژنوتیپ	C/C-Wild C/G- Heterozygote G/G- Mutant Homozygote
نوع نمونه	خون تام
ذخیره	-20°C ± 5
دستگاههای مناسب	ABI
کانال تشخیصی مورد نیاز	Green or FAM

1. نگهداری کیت:

تمامی ویال های کیت باید در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شوند و در این دما تا زمان انقضاء کیت پایدارند. از ذوب و فریز کردن بیش از 3 بار معرفها خوداری شود. در صورتیکه از کیت گهگاهی استفاده میشود بهتر است در زمان انجام اولین تست تمامی معرفها در ویال های مجزا استریل و نشانه گذاری شده دیگر متناسب با مصرف تقسیم شوند تا از ذوب و فریز چند باره جلوگیری شود.

1. دو ویال یکی برای شناسایی الل طبیعی (H63-N Mix) و دیگری برای شناسایی الل جهش یافته (H63-M Mix) وجود دارد. ابتدا آنها را از جعبه کیت خارج کرده و در درون ظرف یخ در دمای اتاق قرار دهید تا به آرامی و کامل ذوب گردد. همچنین یک کنترل هتروزیگوت (H63-Hetero Control) نیز در کیت وجود دارد که آن را نیز در ظرف یخ در دمای اتاق قرار میدهیم تا کاملا ذوب گردد.
2. پس از ذوب کامل هر سه ویال، آنها را به آرامی سروته کرده تا مخلوط شوند و سپس مختصرا Spin نمایید.
3. برای هر بیمار دو تیوب مجزا در نظر گرفته میشود. یکی از تیوب ها با حرف N و دیگری با حرف M در کنار نام بیمار نشانه گذاری میشود. همچنین دو تیوب کنترل مثبت و منفی برای الل نرمال و الل جهش یافته (در مجموع 4 تیوب) آماده و به طور مناسبی نشانه گذاری میشود.
4. درون تمامی تیوب های که قرار است الل طبیعی را شناسایی نماید، 15 میکرولیتر از محتویات ویال H63-N Mix می ریزید. همچنین به درون تمامی تیوب های که قرار است الل جهش یافته را شناسایی نماید، 15 میکرولیتر از محتویات ویال H63-M Mix اضافه نماید.
5. سپس 5 میکرولیتر از DNA ژنومی بیمار استخراج شده به طور مجزا به تیوب N و M مشخص شده همان بیمار اضافه میشود. این عمل برای تیوب های N و M کنترل مثبت و منفی با استفاده از DNA موجود در ویال H63-Hetero Control وWater PCR نیز انجام می گیرد. در صورت داشتن چندین بیمار ، دو استریپ 8 تایی آماده و یکی را برای شناسایی الل طبیعی و دیگری برای شناسایی الل جهش یافته استفاده شود.
6. بعد از گذاشتن کپ ، و Spin تیوب ها ، تیوب ها در دستگاه Real Time PCR بار گذاری شده و برنامه زیر اجراء میشود:

For StepOne Real-Time instrument:

Experiment Type: Quantitation - Comparative Cт (ΔΔCт)

Reagent Type: SYBR Green

Rap Speed Type: Standard

Define Targets:

Target Name	Reporter	Quencher
Normal Allele	SYBR	None
Mutant Alele	SYBR	None

Passive reference: ROX

Denaturation: 95ºC (15 min) x 1 cycle

Cycling: 95ºC (20s), 66ºC (60s)(Data Collection)( SYBR), x 35 cycles

1. تفسیر نتایج:

توجه 1: تفسیر نتایج واکنش الل طبیعی و یا جهش یافته نمونه بیمار در مقایسه با نتایج واکنش تیوب های کنترل منفی و مثبت تعیین می گردد. توجه 2: تفسیر نتایج بر اساس Amplification Plot پس از قرادهی Threshold بالاتر از سیگنال تولیدی واکنش کنترل منفی میکس طبیعی و جهش یافته انجام می گیرد.

الف- ژنوتیپ هموزیگوت طبیعی یا Wild-type : به فردی ژنوتیپ Wild اطلاق میشود که در تیوب حاوی میکس الل طبیعی دارای سیگنال تولیدی مشابه با میکس طبیعی کنترل مثبت بوده در حالیکه در تیوب حاوی میکس الل جهش یافته فاقد سیگنال تولیدی (مشابه با واکنش کنترل منفی ) است (شکل 1) .

• ژنوتیپ هتروزیگوت یا Heterozygote: به فردی ژنوتیپ Heterozygote اطلاق میشود که هم در تیوب میکس الل طبیعی و هم در تیوب میکس الل جهش یافته دارای سیگنال تولیدی مشابه با میکس طبیعی و جهش یافته کنترل مثبت باشد.

• ژنوتیپ هموزیگوت جهش یافته یا Mutant Homozygote : به فردی ژنوتیپ Homozygote موتانت اطلاق میشود که در تیوب میکس الل طبیعی فاقد سیگنال تولیدی (مشابه با واکنش کنترل منفی ) بوده در حالیکه در تیوب حاوی میکس الل جهش یافته دارای سیگنال تولیدی مشابه با میکس جهش یافته کنترل مثبت باشد (شکل 2).

د- آزمایش غیر معتبر: زمانیکه پیک تکثیر و تولید سیگنال در هیچ یک از میکروتیوب های حاوی میکس طبیعی و جهش یافته نمونه بیمار مشاهده نگردد، آزمایش معتبر نبوده و باید مجددا تکرار شود.