شناسایی ژنوتیپ 844A/G- ژن PAI-1

کیت Real-Time PCR شناسایی جهش -844 G>A ژن PAI مناسب برای دستگاه Real-Time ABI Version 1.1

1. محتوای کیت:

Color tube	Content	Quantity
Green	PAI 844-A Mix	400 μl
Blue	PAI 844-G Mix	400 μl
Yellow	PAI(A/G)-Hetero	60 μl
Colorless	Molecular Grade Water

1. ویژگیهای تکنیکی کلی کیت

تکنولوژی	Real-Time PCR
نوع بررسی	کیفی
توالی هدف	پلی مورفیسم ناحیه پروموتوری-844 ژن PAI-1
حساسیت	حداقل 5 ng/µl
اختصاصیت تشخیص	100%
حساسیت تشخیص	100%
ارزیابی ژنوتیپ	A/A-Wild G/A- Heterozygote G/G- Mutant Homozygote
نوع نمونه	خون تام
ذخیره	-20°C ± 5
دستگاههای مناسب	ABI
کانال تشخیصی مورد نیاز	Green or FAM

1. نگهداری کیت:

تمامی ویال های کیت باید در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شوند و در این دما تا زمان انقضاء کیت پایدارند. از ذوب و فریز کردن بیش از 3 بار معرفها خوداری شود. در صورتیکه از کیت گهگاهی استفاده میشود بهتر است در زمان انجام اولین تست تمامی معرفها در ویال های مجزا استریل و نشانه گذاری شده دیگر متناسب با مصرف تقسیم شوند تا از ذوب و فریز چند باره جلوگیری شود.

1. دو ویال یکی برای شناسایی الل طبیعی (PAI 844-A Mix) و دیگری برای شناسایی الل جهش یافته (PAI 844-G Mix) وجود دارد. ابتدا آنها را از جعبه کیت خارج کرده و در درون ظرف یخ در دمای اتاق قرار دهید تا کاملا ذوب گردد. همچنین یک کنترل هتروزیگوت با لیبل PAI(A/G)-Hetero نیز در کیت وجود دارد که آن را نیز در ظرف یخ در دمای اتاق قرار میدهیم تا کاملا ذوب گردد.
2. پس از ذوب کامل هر سه ویال، آنها را چند بار سروته کرده تا خوب مخلوط شوند و سپس مختصرا Spin نمایید.
3. برای هر بیمار دو تیوب مجزا در نظر گرفته میشود. یکی از تیوب ها با حرف N و دیگری با حرف M در کنار نام بیمار نشانه گذاری میشود. همچنین یک تیوب کنترل برای الل نرمال و یک تیوب کنترل برای الل جهش یافته آماده و به طور مناسبی نشانه گذاری میشود.
4. درون تمامی تیوب های که قرار است الل طبیعی را شناسایی نماید، 15 میکرولیتر از محتویات ویال PAI 844-A Mix می ریزید. همچنین به درون تمامی تیوب های که قرار است الل جهش یافته را شناسایی نماید، 15 میکرولیتر از محتویات ویال PAI 844-G Mix اضافه نماید.
5. سپس 5 میکرولیتر از DNA ژنومی بیمار استخراج شده به طور مجزا به تیوب N و M مشخص شده همان بیمار اضافه میشود. این عمل برای کنترل N و M با استفاده از DNA موجود در ویال PAI(A/G)-Hetero نیز انجام می گیرد. در صورت داشتن چندین بیمار ، دو استریپ 8 تایی آماده و یکی را برای شناسایی الل طبیعی و دیگری برای شناسایی الل جهش یافته استفاده شود.
6. بعد از گذاشتن کپ ، و Spin تیوب ها ، تیوب ها در دستگاه Real Time PCR بار گذاری شده و برنامه زیر اجراء میشود:

For StepOne Real-Time instrument:

Experiment Type: Quantitation - Comparative Cт (ΔΔCт)

Reagent Type: SYBR Green

Rap Speed Type: Standard

Define Targets:

Target Name	Reporter	Quencher
844-A Allele	SYBR	None
844-G Allele	SYBR	None

Passive reference: ROX

Denaturation: 95ºC (15 min) x 1 cycle

Cycling: 95ºC (20s), 64ºC (60s)(Data Collection)( SYBR), x 34 cycles

Melt curve analysis from 75ºC to 90 ºC (Data Collection) with raising 1ºC.

1. تفسیر نتایج:

توجه1: بهتر است آنالیز نقطه ذوب برای الل طبیعی و الل موتانت بطور مجزا انجام گیرد. توجه 2: پیک نقطه ذوب در محدوده دمای 73 درجه سانتی گراد مربوط به دایمر پرایمر است. هر چند این پیک نشانه مثبت بودن واکنش نیست ولی حضور آن نشان دهنده عدم حضور مهار کننده در سیستم تکثیری می باشد.

الف- ژنوتیپ هموزیگوت طبیعی یا Wild-type (A/A) : به فردی ژنوتیپ Wild اطلاق میشود که تنها در تیوب حاوی میکس PAI 844-A دارای پیک نقطه ذوب در محدوده دما 82 °C ± 1 بوده در حالیکه تیوب حاوی میکس PAI 844-G فاقد پیک نقطه ذوب باشد(شکل 1) .

• ژنوتیپ جهش یافته (هتروزیگوت) یا (Heterozygote) Mutated(A/G) : به فردی ژنوتیپ Heterozygote اطلاق میشود که در تیوب حاوی میکس PAI 844-A دارای پیک نقطه ذوب در محدوده دما 82 °C ± 1 بوده و در تیوب حاوی میکس PAI 844-G دارای پیک نقطه ذوب در محدوده دما 81 °C ± 1 باشند (شکل 2) .

• ژنوتیپ جهش یافته (هموزیگوت)یا Homozygote Mutated (G/G): به فردی ژنوتیپ Homozygote اطلاق میشود که در تیوب حاوی میکس PAI 844-A فاقد پیک نقطه ذوب بوده در حالیکه تنها در تیوب حاوی میکس PAI 844-G دارای پیک نقطه ذوب در محدوده دما 81 °C ± 1 باشد(شکل 3).

د- آزمایش غیر معتبر: زمانیکه پیک تکثیر و همچنین پیک حاصل از آنالیز نقطه ذوب در هیچ یک از میکروتیوب های حاوی میکس طبیعی و جهش یافته مشاهده نگردد، آزمایش معتبر نبوده و باید مجددا تکرار شود.